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病原研究技术

以淡水白鲨头部溃烂病病原研究为例。

(1) 症状观察,先观察鱼的活力,然后观察体表、头部、鳍部等有无溃烂、出血等,最后观察肝脏、肾脏和肠道等有无病变;

(2) 细菌分离与培养,取肝脏、肾脏内部和头部溃烂处粘液接种于LB培养基,35 ℃培养24 h,挑优势菌落进行纯化;

(3) 生化鉴定,将分离菌株BS1采用全自动细菌鉴定仪和生化反应管结合的方法进行鉴定;

(4) 16S rRNA基因序列测定与系统发育分析,利用细菌16S rRNA通用引物扩增目的基因,送上海生工进行测序,并在NCBI上进行Blast分析比对,选取同源性较高的序列并构建系统进化树;

(5) 药敏实验,药敏试验采用K-B纸片法进行,根据《现代诊断学手册》中药敏试验抑菌圈直径判定标准判断致病菌株对药物的敏感程度;

(6) 人工感染实验,采用腹腔注射、创伤浸泡伤和直接浸泡3种感染方式进行回感,每组6尾鱼,每种感染方式设1个对照组。注射浓度为1×108 cfu /mL,剂量为0.2 mL。创伤感染组划伤皮肤,在浓度为1×107 cfu /mL的菌液浸泡30 min,浸泡组直接在浓度为1×107 cfu /mL的菌液浸泡30 min。统计14 d死亡率。

结合生理生化特征、16S rRNA鉴定及回感试验,确定从患头部溃烂病的淡水白鲨体内分离的菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。


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